北京大学口腔医学院研究员杨瑞莉和博士研究生周宜坤硫化氢修饰的…(北京大学口腔医学院)
巨噬细胞在介导炎症中发挥重要作用，可在不同的刺激下极化成两种不同的亚型m1和m2巨噬细胞。m2巨噬细胞对于抗炎作用及增强骨髓间充质干细胞的骨再生至关重要。然而，直接使用m2巨噬细胞具有难以避免的缺陷，例如长时间的细胞培养过程、细胞扩增过程中的表型变化以及局部移植细胞的低存活率。巨噬细胞控制骨生理的作用在很大程度上是通过旁分泌机制实现的。外泌体，平均直径为30-150nm，由多种细胞分泌并被靶细胞内吞以调节其生物学过程。巨噬细胞的外泌体能在各种生理和病理条件下发挥作用，如免疫反应、感染、癌症和组织损伤等。巨噬细胞外泌体能够促进体外培养的干细胞成骨分化，然而，其确切的效果和细胞相互作用机制仍不清楚。
硫化氢(h2s)，是除一氧化氮和一氧化碳之外的第三种气体信号分子，在炎症和免疫反应中起着重要作用。h2s信号在调控巨噬细胞极化方面起着关键作用。间充质干细胞（mscs）可以内源性产生h2s，通过钙通道调节其自我更新和成骨分化。然而，h2s是否能调节局部免疫反应和炎症以提供合适的微环境来促进成骨分化仍不明确。
本研究表明，h2s促进了m2巨噬细胞的极化，改变了外泌体蛋白谱，使膜联蛋白moesin高度富集，有利于外泌体内吞进入mscs。h2s预处理的m2外泌体能够通过重建局部免疫微环境促进骨再生。
1. h2s促进巨噬细胞极化成m2亚型
首先，研究探究了h2s对巨噬细胞m2极化的作用。h2s供体gyy4137处理通过增加cd115+f4/80+细胞的比率，促进了il-4诱导条件下的m2巨噬细胞极化，增加了精氨酸酶-1(arg-1)的表达。然而，h2s未能改变lps处理下m1巨噬细胞的极化，inos的表达无明显变化。结果表明，h2s促进了巨噬细胞向m2亚型的极化，但对m1巨噬细胞的极化没有显著影响(图1)。
为研究h2s对巨噬细胞外泌体的影响，从巨噬细胞(m0-exo)、m2巨噬细胞(m2- exo)和h2s预处理的m2巨噬细胞(gyy-m2-exo)中分离外泌体，并分析cd63和cd81在这些外泌体中的表达。结果显示在三组中没有检测到显著差异。纳米粒子示踪分析(nta)和透射电子显微镜(tem)结果显示不同处理的巨噬细胞外泌体数量和直径没有明显差异。质谱分析显示蛋白质转运的正调节和内吞作用的正调节位于前十个富集簇。pkh26标记外泌体后处理mscs，结果显示，外泌体在h2s预处理组中显著增多，并以时间依赖的方式增加。我们进一步用流式细胞仪定量测定了12h时细胞对外泌体的内吞，结果显示mscs内吞m2外泌体较m0外泌体增加，而h2s预处理进一步增强了内吞作用（图2）。
为明确h2s预处理的外泌体对骨再生的作用，研究使用m2-exo和gyy-m2-exo治疗临界尺寸的颅骨骨缺损，结果显示m2-exo可以一定程度促进颅骨骨再生。gyy-m2-exo组的颅骨缺损再生效果更优异，其形成新骨结构更规则，与天然骨类似。同时，gyy-m2-exo组中alp和runx2的表达也显著高于m2-exo ，其骨再生区域中富集了更多的arg-1阳性巨噬细胞。这些结果证实了gyy-m2-exo促进骨再生的效果。为进一步验证h2s对骨再生的影响，在对照组和cbs-/-小鼠中建立了颅盖骨缺损，以比较它们的再生能力。结果显示cbs-/-小鼠的再生能力不如wt小鼠。这些结果证实了h2s在调节骨再生中确实起着至关重要的作用（图3）。
wnt/β-catenin通路在骨再生中起着重要作用。研究发现gyy-m2-exo促进了mscs中活化β-catenin的表达，相反， moesin sirna处理降低了mscs中β-catenin的表达。重组moesin蛋白能够促进mscs中活化β-catenin的表达。研究发现moesin促进活化β-catenin的核转位，表明moesin抑制β-catenin的磷酸化和降解，从而促进非磷酸化β-catenin的表达，并在细胞核中进一步发挥相应的生物学作用。
此外， wnt信号抑制剂xav-939处理后m2外泌体促进骨再生的能力被抑制，h2s预处理的m2外泌体通过β-catenin途径促进骨再生。同时研究分析了wnt通路在体内骨再生中的作用，结果表明，gyy-m2-exo处理显著增加活化β-catenin阳性细胞的数量。同时，给予xav-939的小鼠的颅骨骨缺损成骨能力明显降低，缺损并未得到良好的修复。这些结果证实了wnt通路在调节骨再生中起重要作用。gyy-m2-exo具有富集的moesin蛋白，能够促进mscs的外泌体内吞，并通过激活β-catenin信号传导从而增强成骨分化(图4)。
综上所述，本研究发现h2s通过调控来自m2巨噬细胞的外泌体的蛋白质谱来促进m2巨噬细胞极化。富集的m2巨噬细胞moesin蛋白通过β-catenin信号促进mscs内吞摄取外泌体，从而增强msc骨再生。本研究为修饰外泌体从而促进骨再生和组织工程的发展提供了新的策略。
韩春山：北京大学口腔医院2022级硕士毕业生
朱子璐：北京大学口腔医院在读研究生
主要研究方向是基于间充质干细胞的组织再生及其免疫微环境调控，以及生物力学对骨代谢的调控作用及分子机制研究。
bioactive materials, 31 (2024) 192–205.
doi: 10.1016/j.bioactmat.2023.08.006
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2023年bioactivematerials获得影响因子18.9，在materials science，biomaterials领域排名第一。
位于《2022年中国科学院文献情报中心期刊分区表》1区，top期刊。
citescore 2022: 19.7。
